Svarbūs mikroskopijos pasiekimai įgyvendinami pasitelkus būtent netiesines šviesos sąveikas su medžiaga, o poliarimetrinė netiesinė mikroskopija laikoma universalia vaizdinimo priemone, leidžiančia be papildomų žymeklių ir neardant mėginio ištirti fiziopatologinius procesus gyvuose bandiniuose išskiriant tarpląstelines erdvines struktūras, o tai savo ruožtu leidžia ištirti daugelio ląstelių funkcijų mechanizmus.
Siekiant Lietuvoje sukurti ir išplėtoti naujausias netiesinės mikroskopijos vaizdinimo technologijas, pritaikomas biomedicinos poreikiams, taip pat ir vėžio diagnostikai, dirbama kartu su Toronto universitetu Kanadoje. Šio bendradarbiavimo rezultatas – Vilniaus universiteto Fizikos fakulteto Lazerinių tyrimų centro Biofotonikos laboratorijoje sukurtas originalaus daugiamodžio netiesinio poliarizacinio mikroskopo prototipas, kurio galimybės išbandomos kartu su Nacionalinio vėžio instituto Biomedicininės fizikos laboratorijos mokslininkais.
Netiesinės mikroskopijos privalumai
Dar XX a. pirmoje pusėje Nobelio premijos laureatė Maria Goeppert Mayer teoriškai parodė, kad vykstant elektroniniam šuoliui iš pradinės į sužadintą molekulės būseną vienu metu gali būti sugeriamas ne tik vienas didesnės energijos, bet ir du ar daugiau mažesnės energijos fotonų.
Daugiafotonė sugertis audinyje gali sužadinti ir fluorescenciją – nepusiausvyrąjį savąjį švytėjimą, kuris nyksta spontaniškai išspinduliuojant fotonus ir sužadintoms molekulėms grįžtant į pradinę energijos būseną. Dėl daugiafotoniams reiškiniams sužadinti reikalingo didelio spinduliuotės intensyvumo eksperimentiniai matavimai buvo pademonstruoti tik sukūrus lazerines technologijas, o plačiau pradėti taikyti atsiradus ultraspartiesiems lazeriams. Nuo tada pradėta plėtoti ir netiesinė mikroskopija.
Vienas pagrindinių jos pranašumų prieš klasikinę optinę šviesaus lauko ar konfokalinę mikroskopiją (ypač tiriant biologinės kilmės bandinius, gyvus audinius) yra tas, kad žadinimui gali būti naudojama ne pažaidas sukelti galinti didesnės energijos ultravioletinė, o saugesnė didesnio bangos ilgio infraraudonoji spinduliuotė, kuri yra mažiau išsklaidoma ir sugeriama biologiniuose audiniuose, dėl to gali giliau į juos įsiskverbti.
Be to, netiesinė mikroskopija, palyginti su kitais panašiais tyrimų metodais, suteikia galimybę formuoti trimačius vaizdus nepažeidžiant šviesa viso bandinio. Daugiafotoniams netiesiniams reiškiniams būdinga netiesinė priklausomybė nuo žadinimo spinduliuotės intensyvumo – tai reiškia, kad padvigubinę intensyvumą gausime keturis kartus didesnį netiesinį optinį atsaką.
Taigi šie procesai pasireikš tik ten, kur bus viršytas slenkstinis fotonų tankis, pavyzdžiui, objektyvo židinio taške, o visur kitur intensyvumas bus nepakankamas, todėl netiesinis signalas bus gaunamas tik iš labai mažo bandinio tūrio. Be to, diagnostinis vaizdinimas šviesaus lauko mikroskopu formuojant trimačius vaizdus trunka ilgiau nei netiesiniu mikroskopu, nes tam reikalingas didesnis bandinių kiekis ir specialus jų paruošimas, pvz., itin ploni audinių pjūviai, kuriuos padaryti techniškai sudėtingiau.
Ką naujo parodo harmonikų generacijos?
Netiesinis optinis mikroskopas gali būti modifikuotas vaizdinimui paraleliai su keliais netiesiniais vaizdiniais kontrastais. Pagrindinis žadinantis šviesos signalas yra tam tikro dažnio, tačiau, jam sąveikaujant su netiesinėmis savybėmis pasižyminčiu bandiniu, registruojamame signale atsiranda ir kitos dedamosios, kurių dažnis yra pagrindinio signalo dažnio kartotinis. Tai vadinamosios signalo harmonikos.
Daugelis biologinių struktūrų, veikiamų didelio intensyvumo femtosekundinio lazerio spinduliuote, pasižymi ne tik daugiafotonio žadinimo fluorescencija, bet ir harmonikų generacijos efektais, pasireiškiančiais kaip netiesinė sklaida ir nesukeliančiais medžiagos sužadinimo. Antrosios harmonikos generacijos (SHG) atveju du to paties dažnio fotonai netiesinės sąveikos su medžiaga metu generuoja vieną dvigubai didesnio dažnio fotoną, pavyzdžiui, žadinant bandinį neregima infraraudonąja spinduliuote, galima registruoti žalios spalvos signalą.
SHG sąveika pasireiškia necentrosimetrinėse medžiagose, tokiose kaip kolagenai, randami jungiamuosiuose audiniuose ir epitelinio audinio pamatinėje membranoje, ar miozinas raumenyse. Trečiosios harmonikos generacijos (THG) metu, kaip ir SHG atveju, keli to paties dažnio fotonai reaguodami su medžiaga generuoja vieną suminio dažnio fotoną, tačiau šiuo atveju audinys turi pasižymėti jau trečios eilės netiesiniu jautriu. Dažniausiai THG signalas atsiranda tose bandinių vietose, kuriose susikerta skirtingų lūžio rodiklių terpės.
Kadangi vienu metu gali pasireikšti ir keli netiesiniai procesai, registruojant svarbu juos atskirti ir identifikuoti. Tai padaryti galima keičiant optinių filtrų parametrus, derinant žadinimo bangos ilgius arba, kaip šiuo metu technologiškai patogiausia, naudojant daugiakanalę registraciją, t. y. daugiafotonę fluorescenciją nukreipiant į vieną, o SHG ar THG signalus – į kitus kanalus.
Audinius žadinant poliarizuota šviesa, kurioje pasireiškia skirtingas elektrinio lauko stiprio vektoriaus (arba magnetinio lauko stiprio vektoriaus) pokytis įvairiomis kryptimis plokštumoje, statmenoje bangos sklidimo krypčiai, gauname harmonikų generuojamo signalo poliarizaciją, kuri priklauso nuo medžiagos erdvinės molekulinės struktūros ir molekulių konformacinių pokyčių. Todėl programiškai apdorojant netiesiniu poliarizaciniu mikroskopu gautus vaizdus apskaičiuojami parametrai, pagal kuriuos, taikant teorinius sąryšius, galima nustatyti modelinę audinių struktūrą ir jos pokyčius.
Fizikų indėlis į vėžio diagnostiką
Biomedicininėje diagnostikoje audinių fluorescenciją (autofluorescenciją), nulemtą natūralių, jau audiniuose esančių fluorescuojančių gamtinių pigmentų (chromoforų), sudėtinga analizuoti dėl to, kad didelėje fluorescuojančių molekulių sankaupoje sunku identifikuoti tam tikrų molekulių grupių fluorescenciją.
Todėl skirtingoms ląstelių grupėms ar ląstelių sudedamosioms dalims vaizdinti naudojami iš išorės į biologinę struktūrą įvesti chromoforai ar papildomi žymekliai (fluorescenciniai dažai), kurie yra susintetinami pritaikant juos pasirinktiems žinomos charakteristikos audiniams, tad selektyviai kaupiasi atskirose ląstelių organelėse, ar aktyvuojami dėl funkcinių audinių pakitimų. Taigi fluorescencinėje analizėje naudojant žymeklius ar kitaip apdorojant bandinius galima padidinti audinio struktūrinių elementų kontrastą, o kartu ir histopatologinių tyrimų tikslumą.
Patologų auksiniu dažymo standartu vėžio diagnostikoje laikomas audinių pjūvių dažymas standartiniais histologijoje naudojamais dažais – hematoksilinu ir eozinu, kurie suteikia spalvinį kontrastą ląstelės branduoliams, citoplazmai ir tarpląsteliniam užpildui ir išryškina struktūrinius audinių pokyčius. Šiuo metodu dažytiems audinių pjūviams vaizdinti, pritaikius THG vaizdinį kontrastą, taip pat gerai išskiriami ląstelių branduoliai ir kai kurios jungiamojo audinio struktūros.
Natūralus harmonoforas kolagenas netiesiniuose mikroskopijos tyrimuose pats tampa natūraliu audinių žymekliu (1 pav.), nuo kurio išsidėstymo ir orientacijos priklauso matuojama signalo poliarizacija, o ši pakinta vėžiniuose audiniuose.
Todėl lyginant iš vaizduose gaunamų parametrų nustatytus kolageno kiekius, jo struktūrinį homogeniškumą, skaidulų orientacijas ir kryptis sveikuose ir navikiniuose audiniuose galima nustatyti vėžinius audinių pakitimus. Taip pat šie požymiai gali būti naudingi siekiant nustatyti ribas tarp sveiko ir vėžinio audinio. Kolageninis apvalkalas aplink skirtingus vėžinius audinius gali tapti prognostiniu veiksniu, vertinant audinių gebėjimą metastazuoti.
Jeigu kolageninį apvalkalą sudarančios skaidulos apgaubia vėžinius audinius, jos tarsi suformuoja naviką izoliuojantį „barjerą“, tačiau kolageno radialinis išsidėstymas nuo vėžinio darinio centro gali reikšti padidėjusią riziką vėžinėms ląstelėms plisti už naviko ribų. Kolageno vaizdinimo diagnostinė vertė ypač išauga atliekant poliarimetrinius matavimus.
Taigi, į netiesinį optinį mikroskopą įdiegus poliarimetrinio vaizdinimo galimybes, SHG režimas gali atskleisti tarpląstelinės terpės pokyčius, THG vaizdinis kontrastas gali charakterizuoti vėžines ląsteles, o daugiafotonio žadinimo sukelta fluorescencija – padėti nustatyti fiziologinę audinių būseną. Todėl daugiamodė netiesinė mikroskopija gali būti naudojama įvairių žmogaus bei eksperimentinių gyvūnų vėžinių audinių diagnostiniuose tyrimuose.
Naujų vėžio diagnostikos metodų paieškos
Gal nedaug kam žinoma, bet netiesinės poliarimetrinės mikroskopijos technologijas vėžio diagnostikai vienas pirmųjų pradėjo taikyti Vilniaus universiteto absolventas fizikas prof. Virginijus Barzda. Jis su savo komanda Toronto universitete Kanadoje pirmieji pasaulyje parodė, kad netiesiniais mikroskopais galima vaizdinti patologinius audinių pjūvius, pažymėtus būtent minėtais hematoksilino ir eozino dažais, o jų atlikti tyrimai įnešė svarų technologinį ir teorinį indėlį analizuojant struktūrinius audinių pokyčius, svarbius diagnostiniu klinikiniu požiūriu, ir nustatė dėsningumus, pagal kuriuos galima įvertinti skirtingų audinių vėžinius pakitimus ir jų išplitimo ribas. Šiuo metu profesorius dirba Vilniaus universiteto Lazerinių tyrimų centre, vadovauja Lietuvos mokslo tarybos finansuojamam projektui ir dalijasi savo patirtimi ir žiniomis su kitais universiteto mokslininkais.
Bendro darbo vaisius – Vilniaus universiteto Fizikos fakultete sukonstruotas ir vis naujas pritaikymo sritis atrandantis originalaus daugiamodžio netiesinio poliarizacinio mikroskopo prototipas. Atliekant tyrimus šiuo mikroskopu, vėžio metastazių kilmės mechanizmai Valstybiniame patologijos centre paruoštuose bandiniuose gali būti vertinami nustatant tarpląstelinio užpildo struktūrą audinyje ir ją susiejant su vėžinių ląstelių lokalizacija ir išplitimu.
Skirtingos strategijos išbandomos siekiant kontroliuoti užpildo persitvarkymą ir taip mažinti metastazių tikimybę. Sukurti nauji trimatės netiesinės poliarimetrijos matavimo metodai kartu su nauja vaizdų analizės programine įranga, tikimasi, ateityje pagelbės tiriant audinius ir diagnozuojant vėžį ne tik mokslinėse laboratorijose, bet ir klinikose. Tai – nauja netiesinės mikroskopijos taikymų kryptis, galinti palengvinti operacijas ir padėti greičiau aptikti navikus audiniuose.
Tyrimas remiamas pagal 2019–2022 m. Lietuvos mokslo tarybos projekto „Poliarimetrinė netiesinė mikroskopija biomedicininiams tyrimams ir vėžio diagnostikai“ (Nr. 01.2.2-LMT-K-718-02-0016) veiklą „Mokslininkų iš užsienio pritraukimas vykdyti mokslinius tyrimus“.
