Ką nagrinėja epigenetika?
DNR molekulėje saugoma mūsų visų genetinė informacija. DNR yra sudaryta iš grandine išsidėsčiusių keturių skirtingų cheminių vienetų – adenino, guanino, citozino ir timino. Šiuos vienetus galima įsivaizduoti kaip keturias skirtingas spalvas – raudoną, geltoną, mėlyną ir žalią, kurios, besijungdamos viena su kita, suformuoja ilgas įvairiaspalves grandines, koduojančias visą informaciją apie mus: akių, plaukų ir odos spalvą, kraujo grupę, genetiškai paveldimas ligas ir kt. Kiekviena žmogaus organizmo ląstelė turi beveik identiškos spalvinės sudėties grandines. Bet kurių dviejų žmonių DNR grandinės sutampa daugiau kaip 99 proc.
Daugybėje pasaulio laboratorijų siekiama nustatyti molekulinius žymenis, padėsiančius vėžio priežasčių ieškantiems mokslininkams aptikti pačius ankstyviausius DNR pokyčius, lemiančius onkologinę ligą dar prieš jos pradžią.
Jei mūsų genetinė informacija yra identiška, kyla daugybė klausimų: kodėl visi žmonės skirtingi? Kodėl tą pačią genetinę informaciją turinčios ląstelės, pvz., smegenys ir oda, atlieka skirtingas funkcijas? Kodėl sudėtingos, iš dalies paveldimos ligos, tokios kaip vėžys, šizofrenija ar diabetas, pasireiškia senstant?
Atsakymų į šiuos klausimus jau ne vienus metus ieško Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro Biotechnologijos instituto DNR modifikacijos tyrimų skyriaus mokslininkai, vadovaujami profesoriaus Sauliaus Klimašausko. Tyrėjai analizuoja fermentus – DNR metiltransferazes. Šie fermentai vieną iš DNR sudedamųjų elementų – citoziną – modifikuoja nedidele chemine grupe, paversdami jį metilcitozinu, tarsi sukurdami penktąjį DNR spalvinį vienetą, arba, tiksliau, mėlynojo elemento atspalvį DNR grandinėje. Anksčiau minėti keturi DNR grandinės vienetai išsidėsto vienoda seka kiekviename žmoguje, o metilcitozinas, išsidėstydamas skirtingose identiškų DNR grandinių vietose, ir nulemia ląstelių, audinių bei individų skirtumus. Ankstyvojoje embriono vystymosi stadijoje visos ląstelės yra vienodos, visos turi vienodą potencialą pavirsti bet kurio audinio ląstelėmis – nervų, odos ar plaučių. Vystymosi metu iš identiškų embrioninių ląstelių atsiranda įvairūs, besiskiriantys savo funkcijomis audiniai. Jų savybes nulemia skirtinga genetinio kodo, arba genų, raiška.
Nors įvairių audinių ląstelės turi tą patį genų komplektą, jos genetinį kodą išreiškia pagal savo poreikius, skirtingas genų kombinacijas paversdamos į ląstelės funkcijoms būtinus baltymus, fermentus ar įvairias reguliacines molekules. Taigi dėl genų raiškos skirtumų egzistuoja skirtingi audiniai, o genų raišką reguliuoja metilcitozinas, kurį pagal ląstelės poreikius suformuoja DNR metiltransferazės, taip „įjungdamos“ arba „išjungdamos“ reikalingus genus. Nuo griežtai koordinuoto ir laiku įvykusio metilcitozino suformavimo ląstelėje priklauso ne tik audinių savybės, bet ir žmogaus polinkis sirgti įvairiomis ligomis, kai kurie išvaizdos elementai ar net skirtingas charakteris, gyvenimo trukmė.
DNR modifikavimas – tai tik vienas iš veiksnių, kurie lemia genų raiškos ypatumus. Ląstelės genų raišką reguliuoja ne tik metilcitozinas, bet ir tam tikrų DNR surišamų baltymų – histonų – modifikacijos ar nekoduojančios RNR molekulės. Visus šiuos mechanizmus, kurie reguliuoja genų raišką nekeisdami genetinio kodo, nagrinėja epigenetika.
Epigenetiniai tyrimo metodai užkirs kelią ligai
Suprasti epigenetinio reguliavimo mechanizmus tapo dar sudėtingiau atradus papildomus citozino atspalvius – dar tris naujas citozino modifikacijas. Nors jų DNR molekulėse yra daug mažiau nei metilcitozino, joms taip pat būdingas individualus išsidėstymas, svarbus konkretaus audinio veiklai. Kartu su naujomis citozino modifikacijomis buvo atrasti ir ląstelėje už jų suformavimą atsakingi nauji fermentai. Mokslininkai tikisi, kad plečiantis tyrimams bus aptiktos ir dar iki šiol aukštesniuosiuose organizmuose nežinomos DNR modifikacijos.
Tyrėjai nori suprasti citozino modifikacijų, arba citozino atspalvių, kodą. Epigenetikos laboratorijose kuriami metodai DNR modifikacijoms nustatyti, spėjama jų įtaka ląstelės funkcijoms ir ligų atsiradimui. Genetinio ir epigenetinio kodo persitvarkymai būdingi visiems vėžiniams pakitimams. Daugybėje pasaulio laboratorijų siekiama nustatyti molekulinius žymenis, padėsiančius vėžio priežasčių ieškantiems mokslininkams aptikti pačius ankstyviausius DNR pokyčius, lemiančius onkologinę ligą dar prieš jos pradžią. Galimybė nustatyti ir stebėti šiuos pokyčius ankstyvoje stadijoje padėtų užkirsti kelią ligos atsiradimui. Pavyzdžiui, nuo tiesiosios žarnos vėžio pasaulyje per metus miršta per milijoną žmonių. Jei ši liga diagnozuojama anksti, išgyvena 95 proc. pacientų. Tokia liūdna statistika rodo, kaip svarbu suprasti ir atpažinti ligą ankstyviausiose jos stadijose.
Gyvybės mokslų centro mokslininkai siūlo universalų metodą
Epigenetiniai pokyčiai susiję ne tik su vėžinėmis ligomis, bet ir su daugybe kitų kompleksinių ligų ir sutrikimų, tokių kaip šizofrenija ir diabetas, kuriuos sukelia daugybiniai genų raiškos pakitimai. Nors polinkis į šiuos sutrikimus paveldimas, tačiau pirmieji simptomai dažniausiai pasireiškia tik suaugus arba senatvėje.
Drauge su kitais Lietuvos, Kanados ir JAV mokslininkais parodėme, kaip vystosi žarnyno veiklos sutrikimas, susijęs su pieno cukraus, vadinamo laktoze, netoleravimu. Pasaulyje daugiau kaip 65 proc. suaugusiųjų negali vartoti pieno ir jo produktų. Tokių žmonių žarnynas nuo vaikystės gamina vis mažiau laktazės – pieno laktozę skaidančio fermento. Baigiantis kūdikystei, laktazės geno kaimynystėje pradeda kauptis metilinti citozinai, kurie laipsniškai „išjungia“ geną. Šių pokyčių greitis kiekvieno individo atveju gali būti skirtingas ir lemia, kada jam pasireikš šis sutrikimas. Galima spėti, kad tokiu pačiu būdu ant DNR grandinės besikaupiančios epigenetinės modifikacijos sukelia ir kitus genų veiklos sutrikimus, kurie pasireiškia įvairiomis ligomis tik po daugelio metų. Šis tyrimas, kuriam vadovavo Toronto universiteto Priklausomybių ir psichikos sveikatos centro profesorius Artūras Petronis, paskelbtas prestižiniame mokslo žurnale „Nature Structural and Molecular Biology“. Besikaupiančioms epigenetinėms DNR modifikacijoms aptikti panaudota mTAG-seq/chip technologija ir genominių duomenų kompiuterinės analizės metodai. Viena iš mTAG-seq/chip kūrėjų – dr. Edita Kriukienė. Kompiuterinę duomenų analizę atliko dr. Juozas Gordevičius.
Drauge su kitais Lietuvos, Kanados ir JAV mokslininkais parodėme, kaip vystosi žarnyno veiklos sutrikimas, susijęs su pieno cukraus, vadinamo laktoze, netoleravimu.
Dar 2013 m. jungtinė mokslininkų komanda – Biotechnologijos instituto DNR modifikacijos tyrimų skyriaus, prof. A.Petronio vadovaujamos laboratorijos Kanadoje mokslininkai ir jų kolegos iš JAV bei Taivano – mokslo visuomenei pristatė mTAG-seq/chip (ang. methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups sequencing/microarray analysis) DNR metilinimo nustatymo metodą žurnale „Nature Communications“, priklausančiame vienai autoritetingiausių pasaulio mokslo leidyklų „Nature Publishing Group“.
mTAG-seq/chip technologija, skirta citozino modifikavimo laipsniui genome nustatyti, buvo sukurta Biotechnologijos instituto DNR modifikacijos tyrimų skyriuje, remiantis ilgamečiu DNR metiltransferazių tyrinėjimu. Skirtingai nei dauguma epigenetikos metodų kūrėjų, Vilniaus universiteto mokslininkai pasinaudojo neįprastu požiūriu – jie analizuoja ne metilintus citozinus, o priešingai, nustato citozinus, neturinčius jokių modifikacijų citozino ir guanino porose, vadinamosiose CG sekose. Mokslininkai natūraliai nemodifikuotus citozinus pažymi dirbtinėmis cheminėmis grupėmis, kurių padedami atskiria pažymėtas genomo vietas nuo visos genominės DNR. Dirbtinėms cheminėms grupėms įvesti į pagalbą pasitelkiamos žmogui nebūdingos DNR metiltransferazės, išskirtos iš bakterijų, kurios geba atlikti tokias pačias citozino modifikavimo reakcijas kaip ir žmogaus DNR metiltransferazės. Daugiametis įdirbis DNR metiltransferazių mechanizmo tyrimo srityje leidžia kryptingai atlikti reikiamus pakeitimus šiuose fermentuose ir pasukti jų vykdomas reakcijas norima linkme. Natūraliai nemodifikuotų genomo regionų analizė sudarant DNR metilinimo žemėlapius yra daug ekonomiškesnė, paprastesnė ir leidžia jautriai nustatyti nedidelius DNR modifikavimo pokyčius, kurie gali nulemti ligos atsiradimą.
Toks DNR modifikavimo analizės principas tapo ypač patrauklus atradus daugiau nei vieną citozino modifikaciją. Kiekvienai iš jų reikia kurti atskirą metodą, o Gyvybės mokslų centro mokslininkai siūlo tik vieną universalų metodą visų galimų citozino modifikacijų pokyčiams nustatyti bet kuriame genominiame regione.
Paskatino pažangaus epigenominio sekoskaitos metodo sukūrimą
Vilniaus universiteto biotechnologus mTAG-seq/chip sėkmė epigenetiniuose tyrimuose paskatino dar labiau tobulinti šį metodą. Į komandą susibūrę skirtingų sričių mokslininkai dr. E.Kriukienė, prof. S.Klimašauskas, dr. J.Gordevičius, j.m.d. Zdislav Staševskij, dokt. Povilas Gibas nemodifikuotų CG sekų žymėjimą mTAG pritaikė tiesioginiam tokių sekų nustatymui genome pasitelkiant sekoskaitą.
Vis dažniau genominių DNR modifikacijų analizei naudojama viso genomo naujos kartos sekoskaita. Tačiau dėl didelių sąnaudų, būtinų patikimam DNR modifikavimo nustatymui 28 milijonuose žmogaus genomo CG sekų, sekoskaita dar menkai paplitusi epigenetinių ligų tyrimuose. Ieškant epigenetinių ligų DNR žymenų tenka ištirti šimtų pacientų DNR, todėl reta mokslinė laboratorija turi reikiamų išteklių tokio kiekio pacientų viso genomo DNR modifikavimo analizei.
Vilniaus universiteto mokslininkų pateiktas naujasis DNR modifikavimo profilių analizės metodas TOP-seq (angl. Tethered Oligonucleotide-Primed sequencing), pristatytas prestižiniame žurnale „Molecular Cell“ (2017 m. vasaris), leidžia gerokai sumažinti DNR modifikacijų sekoskaitos kainą. TOP-seq gali nustatyti kiekvienos nemodifikuotos CG sekos poziciją genome. Taip išplečiama analizė iki individualaus citozino modifikavimo lygio nustatymo DNR molekulėje. Kuriant šį metodą prie nemodifikuotų citozinų genominėje DNR tyrėjai nusprendė prijungti kitą trumpą DNR molekulę, vadinamąjį universalų DNR pradmenį. Jis tarsi magnetas pritraukia fermentus – DNR polimerazes, gebančias nuo šio pradmens citozino žymėjimo vietoje pradėti dauginti kaimynines DNR sritis. Sekoskaitos būdu įvertinant šių CG sekai kaimyninių DNR sričių kiekį galima nustatyti citozino CG sekoje modifikavimo intensyvumą.
Toks DNR polimerazės gebėjimas atlikti invaziją į genominę DNR, t.y. nuo prijungto pradmens „peršokti“ ant genominės DNR ir pradėti ją dauginti, yra visiškai naujas Vilniaus universiteto mokslininkų atrastas DNR polimerazės mechanizmas.
Tarptautinis pripažinimas
Žurnale „Molecular Cell“ publikuotame straipsnyje Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro mokslininkai pristato žmogaus smegenų žievės, plaučių ir neuroblastomos vėžinių audinių epigenetinio DNR modifikavimo žemėlapių studiją, atliktą TOP-seq metodu. Studija parodė, kad šis metodas pasižymi aukšta skiriamąja geba, jautrumu ir ekonomiškumu. Didelė dalis TOP-seq sėkmės priklauso ir nuo duomenų analizei naudojamų inovatyvių bioinformatikos metodų. Pasak dr. J.Gordevičiaus, bioinformatikos reikšmė tik didės. „Bioinformatikos studijų reikalingumas ateityje jau dabar nenuginčijamas, o tam nereikia nei brangių reagentų, nei išskirtinių technologinių sprendimų – užtenka gebėti mąstyti. Džiugu, kad bendras skirtingų sričių mokslininkų darbas pastebėtas tarptautiniu mastu. Vis ryškesnį pėdsaką pasaulyje palieka ir mūsų šalies tyrėjai“, – džiaugiasi dr. J.Gordevičius.
Vilniaus universiteto mokslininkai įsitikinę, kad naujasis TOP-seq metodas paspartins ir atpigins klinikinius epigenetinių ligų tyrimus. Jį naudojant sekoskaitoje nustatomas ne visas genomas, o tik DNR modifikavimo analizei informatyvios DNR sritys. Toks metodo ekonomiškumas ir paprastumas leis atlikti plataus masto įvairių epigenetinių ligų tyrimus ir galės palengvinti novatoriškų medicinos diagnostikos priemonių kūrimą. Pasitelkiant efektyvius epigenetinių pokyčių nustatymo metodus ir epigenetinius žymenis bus galima atpažinti vėžinius susirgimus, jau minėtas kompleksines žmogaus ligas ar netgi nėščiosios vaisiaus genetinę būseną.
Naujausi moksliniai tyrimai parodė, kad vėžio, diabeto, daugybinės sklerozės, smegenų pažeidimo ir įvairiais kitais atvejais į kraują patenka pažeisto audinio DNR, kuri sudaro vieną iš vadinamosios laisvai cirkuliuojančios DNR komponentų. Kryptingai analizuojant šiuos nedidelius DNR kiekius ir pagal DNR modifikacijų žemėlapį nustatant, iš kurio audinio kilusi laisvai cirkuliuojanti DNR, galima aptikti ligos židinį, o ateityje, tikėtina, bus galima tiksliau stebėti gydymo eigą, sustabdyti ligos vystymąsi. Tai atveria kelius diagnostikos išplėtimui iki neinvazinės ligų diagnostikos ir personalinės medicinos.
Vilniaus universiteto tyrėjai siūlo naujus įrankius, paspartinsiančius ir palengvinsiančius šiuos tyrimus. Per pastaruosius kelerius metus DNR modifikacijos tyrimų skyriaus mokslininkų sukurti unikalūs produktai sulaukė dėmesio Europoje ir JAV – gauti JAV ir Europos patentai, technologijas komercializavo tokios garsios kompanijos kaip „Thermo Fisher Scientific“ ir „Qiagen“.
